一、 实验目的
测定酸模、香蒲、毛茛、青岛藨草、绿萝5种湿地植物在污水净化过程中根内酸性磷酸酶、碱性磷酸酶和脲酶活力。
二、实验方法
1.磷酸酶测定方法
(1)根中酸性磷酸酶的测定;(2)根中碱性磷酸酶;(3)水中酸性磷酸酶;
(4)水中碱性磷酸酶。
2.脲酶测定方法
(1)(1)1)根中脲酶活性：奈氏试剂显色法;(2)水中脲酶活性：同根中脲酶活性测定方法，但酶液是直接取0.5 mL的污水。
三、 实验材料及试剂
1.实验材料
实验室条件下用自制污水培养的5种湿地植物(自移植至实验室新生出的根系要达到一定量);
2.实验中使用的污水是自配污水，配方如下：水1L、淀粉0.067g、葡萄糖 0.05g、
蛋白胨0.033g、牛肉膏0.017g、Na2CO3·10H2O(无水0.02g)0.067g、NaHCO30.02g、Na3PO40.017g、尿素0.022g、(NH4)2SO4 0.028g;
3.实验试剂
磷酸酶、脲酶测定过程中需要试剂：
①0.2mol /L pH7.8磷酸缓冲液
②0.2mol·L – 1 pH 5.8醋酸钠缓冲液
称取醋酸钠16.406g，容量瓶定容至1L，用0.3 mol/L的醋酸溶液调节pH =5.8(用pH计校正)。
③3N NaOH 溶液
④0.05mol·L – 1 pH 8.7Tris–盐酸缓冲液缓冲液
称取12.114克Tris，容量瓶定容至1L，取50毫升0.1M三羟甲基氨基甲烷(Tris)溶液与10.3毫升0.1N盐酸混匀后，加水稀释至100毫升，再用pH计校正。
⑤奈氏试剂：称取7g碘化钾溶于10 ml水中，将10g碘化汞溶于其中。在100ml容量瓶中配置氢氧化钾溶液，称取24.4g加入含有70 ml水的容量瓶中，放置冷却。把配好的碘化钾和碘化汞溶液缓缓加入容量瓶，加入的同时要慢慢摇动，加水稀释至刻度，然后摇匀。将溶液盛放在棕色玻璃瓶中置暗处保存两天后再使用。
⑥10%三氯乙酸
⑦10%酒石酸钾钠
4.实验仪器
高温消解器、紫外分光光度计、离心机、恒温水浴锅、pH计、研钵、高压灭菌锅、50mL 具塞(磨口)刻度管。
四、 实验过程
1.系统设置
取30个1L容量的大烧杯，洗净。将生长态势比较一致的5种植物从清水中取出，植物根部用15%的双氧水灭菌处理10分钟后，用蒸馏水清洗干净，按照每组湿地植物湿重相等的原则，放入大烧杯。将烧杯分成5组，分别栽种香蒲、绿萝、青岛藨草、酸模、毛茛，每一组由两小组组成，栽种香蒲的两小组编号为X和X0，栽种绿萝的两小组编号为L和L0，栽种青岛藨草的两小组编号为Q和Q0，栽种酸模的两小组编号为S和S0，栽种毛茛的两小组编号为M和M0，每组中前者中加入250ml 自配污水，后者作为对照加入等量的自来水。
2.测定方法
2.1磷酸酶测定方法
2.1.1根中酸性磷酸酶：
酶液提取：称取植物根系材料0.1g，放入研钵，再向其中加入1ml磷酸缓冲液(PH7.8)，小心研磨至匀浆，再将其全部吸入离心管中，在0℃下1200r/min转速的条件下，离心30min，上清液为待测液，取0.5 ml。
具体方法：取配置好的pH 为5.8的0.2mol·L – 1 醋酸钠缓冲液70ml ，以之为溶剂配成浓度为0.15g·L – 1对硝基苯磷酸二钠(pNPP) 酶反应液，加入0.5 ml酶液后将其用黑纸包裹，置于25 ℃下培养1小时。向其中加入1ml3N NaOH 溶液，以终止酶促反应，使用α-1860S紫外可见分光光度计在405nm 波长处进行比色测定。在单位时间内单位重量鲜根水解pNPP 生成的pNP量来表示酶活性(μg·h – 1·g – 1鲜根)。
2.1.2根中碱性磷酸酶：测定方法与酸性磷酸酶的类似，唯一的区别是酶反应液是由Tris-HCl缓冲液(pH = 8.7) 配制的。
2.1.3水中酸性磷酸酶：取0.5 ml污水作为水中酸性磷酸酶的酶液。具体方法同根中酸性磷酸酶。
2.1.4水中碱性磷酸酶：取0.5 ml污水作为水中碱性磷酸酶的酶液。具体方法同根中碱性磷酸酶。
2.2脲酶测定方法
2.2.1根中脲酶活性：奈氏试剂显色法。
酶液提取：称取植物根系材料0.1g，放入研钵，再向其中加入1ml磷酸缓冲液(PH7)，小心研磨至匀浆，再将其全部吸入离心管中，在0℃下1200r/min转速的条件下，离心30min，上清液为待测液，取0.5 ml。
具体方法：取适量的干净试管，并给试管编号，依次向其中加入2 mL 0.3 mol/L 尿素-0.05 mol/L 磷酸盐缓冲溶液(pH 7)，然后将试管放入37 ℃恒温水浴锅中，并预热5 min。1号管作为空白对照，向其中加入0.5 mL 水，向其余试管分别加入0.5 mL酶液，将所有试管混匀后在37 ℃水浴锅中恒温水浴条件下反应5 min。在反应结束后向各个试管加入1.5 mL 10%三氯乙酸使反应终止。取其中的1 mL 反应液，加入9mL 蒸馏水稀释反应液，摇匀后先加入0.5 mL 10%酒石酸钾钠反应一会，再加入1.0 mL 奈氏试剂显色。在波长420 nm时测定各管溶液的吸光度，1 号管作对照。最后做出硫酸铵浓度标准曲线，据此方程计算酶活， 测得铵浓度与吸光度关系拟合方程为OD420=0.006C+0.0082(R2=0.9991)。
2.2.2水中脲酶活性：同根中脲酶活性测定方法，但酶液是直接取0.5 mL的污水。
五.实验结果及分析
同样每隔48小时测定湿地植物根内及水体中的酸性磷酸酶、碱性磷酸酶和脲酶活力变化情况见图2-1~图2-15。
由图2-1可知，不同湿地植物根中碱性磷酸酶活性的变化趋势不同。同一种湿地植物的污水处理组和空白对照组中的碱性磷酸酶活性的变化趋势一致，且空白对照组中的该酶的活性高于污水处理组中的活性，两者之间的差距随时间增大。毛茛和绿萝的空白对照组及污水处理组的根中碱性磷酸酶活性变化趋势相似，均先剧烈下降后缓慢增多或保持较小幅度的变化。在香蒲、青岛藨草和酸模的空白对照组及污水处理组中该酶活性波动较小，香蒲和青岛藨草中的趋势是先增加后降低，酸模中的趋势是随时间延长缓慢增加，在后期增幅较大。总体上5种植物根中碱性磷酸酶活性进行排序，绿萝中最高，香蒲次之，然后是青岛藨草，接着是毛茛，最后是酸模。
图2-2可知，整体上5种植物根中脲酶活性的变化趋势较一致，大体上呈增加的趋势，且在96小时至144小时之间根中脲酶活性增加显著。5种植物的空白对照组中的根中脲酶随时间延长呈递增趋势，与空白对照组相比，5种植物的污水处理组的根中脲酶活性波动较大，毛茛、香蒲、青藨和酸模的污水处理组中的根中脲酶活性先升高后下降然后再增加，而绿萝的污水处理组中的根中脲酶活性先下降后增高再略有下降。总体上对5种植物根中脲酶活性进行排序，绿萝中最高，香蒲次之，然后是酸模，接着是青岛藨草，最后是毛茛。
由图2-3可知，5种植物的水体中酸性磷酸酶活性没有统一的变化趋势，而每种植物的污水处理组和空白对照组中酸性磷酸酶的变化趋势基本一致。在毛茛、酸模和绿萝的空白对照组及污水处理组中，水体中酸性磷酸酶活性均呈先升高后下降的趋势;香蒲和青岛藨草的空白对照组及污水处理组中，除了香蒲的污水处理组中出现先下降再升高，水体中酸性磷酸酶活性均随时间延长在逐渐增大。
由图2-4可知，5种植物的水体中碱性磷酸酶活性没有统一的变化趋势，而每种植物的污水处理组和空白对照组中变化趋势基本一致。毛茛和绿萝的污水处理组中，水体中碱性磷酸酶活性呈下降趋势;毛茛和绿萝的空白对照组和酸模、青岛藨草的污水处理组及空白对照组中，该酶活性均呈先上升后下降的趋势;香蒲的空白对照组和污水处理组中，该酶活性均呈上升趋势。
由图2-6和2-7可知，总体上，除了酸模的空白对照组在后期出现下降，5种湿地植物的空白对照组和污水处理组中，水体中脲酶活性均有上升的趋势，在后期有较大增幅。毛茛的污水处理组、香蒲的空白对照组及污水处理组、青岛藨草的空白对照组及污水处理组中，水体中脲酶活性呈先下降后升高的趋势;毛茛的空白对照组中，酸模的污水处理组和绿萝的空白处理组及污水处理组中，该酶活性呈上升趋势;酸模的空白对照组中，该酶活性呈先上升后下降趋势。基本上，5种植物的污水处理组中的水体中脲酶活性大于空白对照组中的。
