1927年7月中旬，聂荣臻被指定为中共前敌军委书记，赴九江准备组织武装起义。1927年8月1日，聂荣臻在南昌起义中组织张发奎部第25师两个多团起义，后任起义军第11军党代表，与军长叶挺率部南下。潮汕战斗失败后，聂荣臻转赴香港。1927年12月，聂荣臻潜回广州参与领导广州起义。在起义军受挫的紧急情况下，聂荣臻与叶挺果断决定撤退，从而保存了部分革命武装力量。1928年，聂荣臻任中共广东省委军委书记，其间，在总结广州起义的经验教训时，聂荣臻看到了军事技术人才的缺乏是广州起义的一个重要缺点，指出：“以后每个党员都应该学习军事技术，并须注意培养一批军事技术人才。”显示了他在军事方面的远见卓识。1930年初，聂荣臻任中共顺直省委组织部部长，1930年5月到达上海，在中央特科从事艰险而又复杂的地下工作，积极向各革命根据地提供军事情报，及时了解敌情，保卫党中央和地下党同志的安全，营救被捕同志，镇压叛徒、特务。1931年，聂荣臻调到任参谋长，先后在香港、天津、上海等地坚持秘密斗争。
自从顾顺章叛变以后，国民党反动派在上海的白色恐怖日益严重。像聂荣臻这样与顾顺章共过事的共产党骨干人物，已不便继续留在上海。当时，毛泽东领导的井冈山革命根据地得到迅速发展，正需要聂荣臻这样的军事人才。1931年12月，聂荣臻根据组织的决定撤离上海，前往江西中央革命根据地。聂荣臻先后任中国工农红军总政治部副主任、第1军团政治委员。曾当选为中华苏维埃共和国中央执行委员。1932年3月，在“左”倾冒险主义的执行者要中央红军夺取赣江两岸城市时，聂荣臻支持毛泽东关于红军主力应向国民党统治薄弱的地区发展的正确意见。同年4月，聂荣臻作为红军东路军政治委员，参与指挥漳州战役。聂荣臻在指挥战斗中表现出的沉稳和勇敢给毛泽东留下了极好的印象，同时，毛泽东一系列正确的战略、战术和政策思想以及领导才能，使聂荣臻由衷地钦佩。聂荣臻从毛泽东那里学到的正确的战略战术思想和策略思想，对其以后领导一个大的战略区增益很大。
1934年10月，红军开始了历史上著名的二万五千里长征。蒋介石在红军前进的道路上设置了四道封锁线。聂荣臻与军团长林彪率红1军团担任掩护中央纵队、军委纵队的前卫任务。聂荣臻率部先后突破国民党第一、二道封锁线，并在危急形势下，力排众议，率部抢占九峰山，突破敌人第三道封锁线，从而保障了中央纵队左翼的安全。
红军突破三道封锁线使蒋介石坐立不安。为了围歼红军于湘江以东地区，蒋介石费尽心机，调遣湖南、广东、广西的军阀部队，进行周密布置，对红军进行围追堵截。但是，反动军阀内部的派系矛盾和唯利是图使湘江防线曾出现过“裂痕”。然而，由于博古等人缺乏军事常识，没有抓住有利战机，使红军在湘江畔陷入被动。为了掩护中央纵队顺利过江，林彪、聂荣臻率部在湘江之滨与敌人展开了一场生死存亡的拼杀，在损失惨重的情况下，中央红军终于突破敌第四道封锁线。
遵义会议后，聂荣臻在毛泽东领导下，与林彪率部四渡赤水，巧渡金沙江，摆脱了敌重兵的围追堵截。1935年5月，聂荣臻任红军先遣队政治委员，与司令员刘伯承一起，率部通过大凉山彝族区，抢占安顺场，组织突击队强渡大渡河，接着率红1师、干部团沿大渡河东岸北上，击溃川军守敌一个旅，有力地策应了西岸红2师4团飞夺泸定桥的战斗。1935年6月中旬，聂荣臻率红1师翻越夹金山，在懋功与红四方面军先头部队会师。1935年6月下旬，在列席两河口中央政治局会议上，聂荣臻拥护中央关于北上建立川陕甘革命根据地的方针，坚决反对张国焘的分裂活动。1935年8月下旬，聂荣臻率红1师、红军大学等部为先遣队，历经艰辛，越过大草地，1935年9月上旬到达俄界，接应了中央及红3军等部队。1935年9月中旬，聂荣臻与左权指挥红4团攻占天险腊子口，并乘胜占领哈达铺，再次为红军打开了北上通道。在哈达铺，聂荣臻偶然从国民党《山西日报》上获悉陕北有一个根据地，并把这一天大的喜讯急告毛泽东。毛泽东决定挺进陕北。1935年10月，聂荣臻与林彪率先遣队进入陕北苏区的吴起镇，从此结束了历时一年、行程二万五千里的长征。1935年11月下旬，在毛泽东指挥下，聂荣臻与林彪率红1军团取得直罗镇战役的胜利。毛泽东说，直罗镇这一仗的胜利，体现了中央红军同西北红军兄弟般的团结，粉碎了国民党军向陕甘边区的“围剿”，给党中央把全国革命大本营放在西北的任务，举行了一个奠基礼。
红军到陕北后，为了配合“一二九”运动，同时也为了解决陕北红军的供给问题，毛泽东命令红一方面军成立“中国人民红军抗日先锋军”，东渡黄河，以坚决手段消灭东岸地区反蒋不抗日的山西土皇帝阎锡山。聂荣臻、林彪与红1军团广大指战员投入到了东渡黄河的战斗中。东征75天，聂荣臻、林彪和兄弟部队合作，共消灭敌人七个团，俘敌4000余人，缴获大量枪炮，不仅使陕北苏区得到恢复和发展，还筹款30余万，扩充新兵8000余人，有力推动了抗日民族统一战线以至全国的抗日救亡运动的发展。
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